Campione microfantoccio a dispersione 3D per valutare l'accuratezza quantitativa nelle tecniche di microscopia in fase tomografica

May 30, 2023

Scientific Reports volume 12, numero articolo: 19586 (2022) Citare questo articolo

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In questo articolo presentiamo una struttura di scattering biomimetica strutturalmente complessa, fabbricata con polimerizzazione a due fotoni, e utilizziamo questo oggetto per valutare un sistema di imaging computazionale. Il fantasma consente di personalizzare lo scattering modificandone i gradi di libertà, ovvero il contrasto dell'indice di rifrazione e le dimensioni dello strato di scattering, e incorpora un test di qualità dell'immagine 3D, che rappresenta una singola cellula all'interno del tessuto. Sebbene il campione possa essere utilizzato con più tecniche di microscopia 3D, dimostriamo l'impatto dello scattering su tre metodi di ricostruzione della microscopia in fase tomografica (TPM). Uno di questi metodi presuppone che il campione abbia una diffusione debole, mentre gli altri due tengono conto della diffusione multipla. Lo studio viene eseguito a due lunghezze d'onda (visibile e vicino infrarosso), che servono come fattore di scala per il fenomeno dello scattering. Troviamo che il cambiamento della lunghezza d’onda dal visibile al vicino infrarosso influisce sull’applicabilità dei metodi di ricostruzione TPM. Come risultato della ridotta diffusione nella regione del vicino infrarosso, le tecniche orientate allo scattering multiplo hanno infatti prestazioni peggiori di un metodo mirato a campioni a diffusione debole. Ciò implica la necessità di selezionare l'approccio appropriato in base alle caratteristiche di scattering del campione, anche in caso di sottili cambiamenti nell'interazione oggetto-luce.

Una delle sfide moderne dell'ottica computazionale è quella di visualizzare campioni di scattering ad alta risoluzione1. Ciò può essere attribuito al fatto che strutture biologiche complesse come sferoidi o organoidi tendono ad essere modelli più rilevanti rispetto alle colture cellulari 2D, ad esempio per la scoperta di farmaci2. Inoltre, la maggior parte delle tecniche di imaging in vivo richiedono che la luce di sondaggio passi attraverso la struttura complessa di un tessuto, il che limita notevolmente la profondità di imaging a causa della diffusione multipla. Questa richiesta stimola lo sviluppo di nuovi metodi1,3,4,5, tuttavia, è difficile selezionarne uno appropriato in base alla forza di dispersione del campione analizzato. Per questo motivo è essenziale un metodo versatile, ripetibile e quantitativo per la valutazione di diversi sistemi e algoritmi di imaging per determinarne i limiti di applicabilità in base alle proprietà di scattering dell'oggetto. Una possibilità è quella di utilizzare microfantasmi calibrati come target di imaging. Sfortunatamente, i microfantasmi esistenti sono in genere a dispersione debole (ad esempio microsfere con indice corrispondente) o eccessivamente semplicistici (ad esempio microsfere con indice non corrispondente)6,7 rispetto ai tipi di campioni multicellulari a dispersione eterogenea a cui sono destinati i metodi di diffusione multipla. Questa è una limitazione critica quando si caratterizzano metodi di imaging computazionale che utilizzano solutori non convessi, dove la convergenza iterativa dipende dalla complessità del panorama energetico ed è direttamente associata alla complessità 3D di un campione8.

In questo lavoro presentiamo un microfantasma stampato in 3D con distribuzione dell'indice di rifrazione (RI) a diffusione multipla. Per fare ciò, sfruttiamo i recenti sviluppi nella stampa 3D tramite scrittura laser diretta9,10,11,12. Tra le molteplici tecniche di stampa 3D disponibili13,14,15,16,17,18, abbiamo scelto una polimerizzazione a due fotoni che consente la stampa 3D di campioni microphantom con geometria nota e RI calibrato. Rispetto ad altre implementazioni di scrittura laser diretta, consente (1) di controllare l'RI con un intervallo di modulazione relativamente alto, (2) di regolare il contrasto dell'RI o la forza di diffusione post-fabbricazione utilizzando liquidi di immersione diversi e (3) di gestire e misurare il microfantoccio allo stesso modo dei campioni biologici. Successivamente, presentiamo l'applicazione del fantasma nel campo della microscopia in fase tomografica (TPM), una tecnica che ha dimostrato risultati impressionanti di imaging biologico in lavori precedenti. Tuttavia, è importante notare che tutti i metodi di imaging computazionale possono essere valutati con la procedura proposta.